微囊藻毒素ELISA檢測試劑盒(OunuoAT91001)
一、概要
隨著中國水體的富營養化程度逐漸加劇，藍藻水華和赤潮的發生逐漸增加。80% 的藍藻水華都可以檢測出次生代謝產物---微囊藻毒素（microcystins，MCs），它對水體環境和人群健康的危害已成為大家關注的重大環境問題之一。微囊藻毒素為七肽單環肝毒素，結構中存在著環狀結構和間隔雙鍵，因而具有相當的穩定性，它能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性，當細胞破裂或衰老時毒素釋放進入水中，同時它還是強烈的肝臟腫瘤促進劑。MC是一種單環七肽物質，具有明顯的肝細胞毒性。由于多肽中兩種可變氨基酸組成的不同，具有多種異構體。其中存在含量最多的是MC-LR，MC-RR，MC-YR這3種微囊藻毒素。研究表明，MC-LR的急性毒性很強，MC-YR次之，MC-RR最弱。
二、原理
本試劑盒采用間接競爭法。酶標板微孔中預包被微囊藻毒素抗原，樣品中殘留的微囊藻毒素與微孔板上的抗原競爭微囊藻毒素抗體，加入酶標二抗后，用TMB顯色，吸光值與樣品中微囊藻毒素含量成負相關。
三、試劑盒組成
包被有抗原的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）
高濃度標準品100ng/mL：1 瓶× 1mL
標準品工作液：0、0.075、 0.225、 0.675、 2.0ng/mL 1 瓶× 1mL
微囊藻毒素抗體： 1 瓶 × 8mL
酶標二抗：1 瓶 × 15mL
10× 濃縮洗滌液：1 瓶 × 50mL
sample diluent：1 瓶 × 50mL
顯色底物液（TMB）：1 瓶 ×17mL
終止液：1 瓶 × 7mL
試劑盒說明書
質檢報告
四、需要的儀器、試劑
1）儀器
酶標儀450nm（iELisa全自動酶標儀或相當者）
離心機
微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL
50mL離心管
8道微量移液器
酶標板振蕩器
天平：感量0.01g
五、樣品處理
1. 水樣品---飲用水、地表水
直接吸取50μL澄清樣品用于檢測。
稀釋倍數：1
2. 海水
吸取100μL澄清樣品與900μLsample diluent，混勻；
直接吸取50μL澄清樣品用于檢測。
稀釋倍數：5 （由于海水存在基質效應問題，根據大量的數據支撐，稀釋因子由10變更為5）
六、酶聯免疫分析程序
1. 測定之前注意事項
1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2) 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
3) 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序的要點。
4) 所有孵育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標板。
2. 溶液的配制
1) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍后使用（1份濃縮洗滌液加9份蒸餾水）。
3. 測定程序
1) 將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2) 分別吸取50μL 標準品和樣品加至相應的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL微囊藻毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標準和樣品必須使用新的吸頭）。
3) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
4) 加入100μL酶標二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標準和樣品必須使用新的吸頭）。
5) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
6) 每孔加入100μL底物， 室溫避光溫育10分鐘。
7) 每孔加入50μL終止液，混勻。
8) 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。
七、 結果判定
1. 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以0個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以百分數，即百分吸光度值。
以微囊藻毒素準品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件，更便于大量樣品的快速分析。
2. 樣品的實際濃度為讀數結果乘以相應稀釋倍數。
3. 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩沖液進行稀釋。
八、 注意事項
1. 室溫低于20℃或試劑及標本未回到室溫（20- 25℃）會導致數值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現板孔干燥過久的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3. 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
4. 混合要均勻，洗板要干凈（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）。
5. 反應停止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。
6. 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產廠家的試劑盒這樣會引起靈敏度降低。
7. 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。
九、檢測方法靈敏度、準確度、精密度
1. 精密度:批內變異系數<10%（n=10），批間變異系數<25%(n=10)。
2. 靈敏度：0.075ng/mL。
3. 樣本檢測線：
飲用水、地表水........................................0.075ng/mL
海水 ..........................................0.75ng/mL
4. 準確度:
飲用水、地表水 .......................................90%±25%
海水 ........................................................ 90%±25%
